کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) -

روش ها، مزایا و کاربردها

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (HPLC) یک روش کروماتوگرافی است که برای جداسازی مخلوطی از ترکیبات در شیمی تجزیه و بیوشیمی به منظور شناسایی، تعیین کمیت یا خالص سازی اجزای جداگانه مخلوط استفاده می شود.

HPLC فاز معکوس یا کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا (UHPLC) یک حالت جداسازی متداول است. حفظ دینامیکی ترکیبات دارای عملکرد آبگریز و آلی را فراهم می کند. ترکیبی از برهمکنش‌های آبگریز و نوع واندروالسی بین تمام ترکیب هدف و هر دو فاز ثابت و متحرک، حفظ این ترکیبات را با فاز معکوس امکان‌پذیر می‌سازد.

HPLC چگونه کار می کند؟

در مقادیر بسیار کم، مخلوط نمونه ای که قرار است جدا شود و آزمایش شود، از طریق یک ستون به جریان فاز متحرک نفوذ می کند. انواع مختلفی از ستون ها با جاذب هایی با اندازه و سطوح مختلف ذرات موجود است.

مخلوط با سرعت های مختلف در ستون حرکت می کند و با جاذب که به عنوان فاز ساکن نیز شناخته می شود، برهم کنش می کند. سرعت هر جزء در مخلوط به 1) ماهیت شیمیایی آن، 2) ماهیت ستون و 3) ترکیب فاز متحرک بستگی دارد. زمانی که یک آنالیت خاص از ستون خارج می شود، زمان ماندگاری آن نامیده می شود. زمان ماند تحت شرایط خاص اندازه گیری می شود و به عنوان مشخصه شناسایی یک آنالیت معین در نظر گرفته می شود.

ذرات جاذب ممکن است ماهیت آبگریز یا قطبی داشته باشند. فازهای متحرک که معمولاً مورد استفاده قرار می گیرند شامل هر ترکیب قابل اختلاط آب و حلال های آلی مانند استونیتریل و متانول است. از فازهای متحرک بدون آب نیز می توان استفاده کرد.

جزء آبی فاز متحرک ممکن است حاوی اسیدهایی مانند اسید فرمیک، فسفریک یا تری فلورواستیک یا نمک باشد تا امکان جداسازی اجزای نمونه را فراهم کند. ترکیب فاز متحرک یا به عنوان یک ثابت یا به عنوان متغیر در طول تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی حفظ می شود. رویکرد ثابت برای جداسازی اجزای نمونه که از نظر میل ترکیبی با فاز ساکن چندان متفاوت نیستند، مؤثر است. در رویکرد متنوع، ترکیب فاز متحرک از قدرت شستشوی کم تا بالا متفاوت است. قدرت شستشوی فاز متحرک با زمان‌های ماند آنالیت منعکس می‌شود که در آن قدرت شستشوی بالا شستشوی سریع ایجاد می‌کند.

ترکیب فاز متحرک بر اساس شدت فعل و انفعالات بین چند جزء نمونه و فاز ساکن انتخاب می شود.

فرآیند پارتیشن بندی HPLC کاملاً شبیه به فرآیند استخراج مایع-مایع است با این تفاوت که اولی یک فرآیند پیوسته است، برخلاف دومی که یک فرآیند گام به گام است. توصیه می شود که فرآیندهای پارتیشن بندی آزمایشی برای تعیین روش دقیق HPLC که جداسازی کافی را فراهم می کند، انجام شود.

تولید کنندگان سیستم های HPLC

امروزه طیف گسترده ای از گزینه های HPLC در بازار وجود دارد. در زیر لیستی از تولیدکنندگان مختلف سیستم HPLC با معرفی مختصری از محصولات آنها آمده است:

• Dionex، یک شرکت مبتنی بر علم کروماتوگرافی، سیستم UltiMate® 3000 Rapid Separation LC، سیستم Ultimate 3000 RSLCnano و خانواده Corona® آشکارسازهای آئروسل باردار جهانی را تولید می کند.
• Jasco Analytical Instruments طیف وسیعی از سیستم های HPLC را ارائه می دهد. سیستم های HPLC سری LC-2000 Plus به طور منحصر به فردی قابل تنظیم هستند. با کارایی بالا و هزینه کم، این سیستم های HPLC می توانند تقریباً با هر نیازی از QA ایزوکراتیک ساده تا توسعه روش پیشرفته چند حلال/چند ستونی سازگار شوند. Isocratic LC-2000plus-Iso دارای پمپ، گاززدا، نمونه برداری خودکار و آشکارساز UV/Vis است. این پمپ با دبی 1 میکرولیتر تا 10 میلی لیتر در دقیقه در فشار تا 500 بار برای استفاده در ستون های ID 2، 3، 4، 6 و تا 10 میلی متر طراحی شده است. Binary Gradient LC-2000plus-HPG مشابه سیستم ایزوکراتیک است اما با پیکربندی پمپ گرادیان دو حلال ارائه شده است. دبی پمپ با ستون های 1 میلی متری سازگار است. گرادیان کواترنری LC-2000plus-LPG نیز مشابه سیستم ایزوکراتیک است. با این حال،
• سیستم HPLC آماده سازی از Gilson دارای محدوده جریان گسترده ای است که می تواند برای جداسازی نیمه آماده سازی و آماده سازی سازگار شود. قدرت پمپاژ بالای آن طیف وسیعی از اندازه ستون های آماده سازی را امکان پذیر می کند. این سیستم با سیستم ایستگاه شستشوی جدید طراحی شده است که شامل جت شستشوی روان است و امکان استفاده از حداکثر دو حلال آبکشی مختلف را فراهم می کند.
• سیستم‌های HPLC شارپ از AAPPTec با پمپ‌هایی ارائه می‌شوند که با ریزپردازنده کنترل می‌شوند، بنابراین نرخ‌های جریان بسیار دقیق و بسیار دقیق را ممکن می‌سازند، که می‌تواند به دستیابی به تکرارپذیری تحلیلی عالی و بالاترین دقت اندازه‌گیری کمک کند.

دیگر تولیدکنندگان در بازار فعلی Waters،Agilent، Beckman Coulter، Bio-Rad و Buck Scientific هستند.

مزایای HPLC

مزایای کلیدی سیستم های HPLC به شرح زیر است:

• ابزار دقیق کروماتوگرافی را کنترل و خودکار می کند
• مدیریت داده ها، ویژگی های امنیتی، و گزارش و اعتبار سنجی ابزار را ارائه می دهد.
• قدرتمند و سازگار
• بهره وری را با مدیریت تمام حوزه های تجزیه و تحلیل - از نمونه تا ابزار، و از جداسازی تا گزارش نتایج افزایش می دهد.
• مقرون به صرفه

کاربردهای HPLC

هدف اصلی تکنیک HPLC شناسایی، تعیین کمیت و خالص سازی یک آنالیت یا ترکیب خاص است. هم تحلیل کمی و هم کیفی قابل انجام است. HPLC ها را می توان در موارد زیر استفاده کرد:

• تصفیه آب
• تشخیص ناخالصی ها در صنایع داروسازی
• پیش تغلیظ اجزای کم مصرف
• کروماتوگرافی تبادل لیگاند
• کروماتوگرافی تبادل یونی پروتئین ها
• کروماتوگرافی تبادل آنیونی با pH بالا کربوهیدرات ها و الیگوساکاریدها

تماس با ما:

جهت دریافت کاتالوگ محصولات و قیمت روز با بخش فروش شرکت ویتا طب تماس حاصل فرمایید

• تماس: 02122277131-02122919474-02166714383

  همراه:09199060602

  فکس: 02122919474

  ایمیل:sales1.vtk@gmail.com

HPLC در کاربردهای دارویی

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک تکنیک تحلیلی فوق العاده مفید با طیف وسیعی از کاربردها است. HPLC شامل ستونی از مواد جاذب (مانند دانه های سیلیس) است که نمونه تحت فشار از آن عبور می کند. هر یک از اجزای مخلوط نمونه به طور متفاوتی با مواد موجود در ستون تعامل خواهد داشت و به این ترتیب، سرعت جریان متفاوتی دارد. در نتیجه، اجزای مختلف در زمان‌های مختلف ستون را ترک می‌کنند و می‌توانند جداگانه جمع‌آوری شوند. تجزیه و تحلیل کیفی و کمی می تواند هویت هر جزء و ترکیب نمونه را تعیین کند.

HPLC به عنوان ابزاری حیاتی در انواع کاربردهای دارویی، از جمله ارزیابی فرمولاسیون، بررسی خلوص، و نظارت بر تغییرات ناشی از تنظیمات فرآیند یا در حین افزایش مقیاس در نظر گرفته می شود.

هنگام استفاده از HPLC، مهم است که بدانید برای هر برنامه چه عواملی را باید در نظر بگیرید. به عنوان مثال، روش‌های مختلف HPLC برای انتخاب وجود دارد. نگرانی خاص در مورد داروها الزامات قانونی است که ممکن است تعیین کند که کدام تجهیزات و مشخصات باید استفاده شود. اینها اغلب توسط داروسازی ایالات متحده مشخص شده است.

برای کشف موارد استفاده اصلی HPLC در کاربردهای دارویی و فاکتورهای اصلی که باید هنگام تعیین تنظیمات بهینه برای برنامه خود در نظر بگیرید، مطالعه کنید.

استفاده از HPLC در کاربردهای دارویی

HPLC یکی از مفیدترین روشهای تحلیلی در توسعه و ساخت مواد دارویی است. کاربردهای آن فقط به یک حوزه محدود نمی شود و در تعدادی از مراحل حیاتی لازم برای تجزیه و تحلیل دارویی قوی نقش دارد.

جید سی. برد، مدیر بخش جداسازی فاز مایع (LPSD) در Agilent Technologies، خاطرنشان می کند که «HPLC یک تکنیک بسیار همه کاره است که می تواند به محققان دارویی (بیولوژیکی) و تأسیسات تولیدی کمک کند تا به طور کامل نامزدهای دارویی یا درمانی بالقوه را مشخص کنند. و اطمینان حاصل کنید که داروها به روشی ایمن و سازگار تولید می شوند. به گفته برد، آزمایش‌های تحقیقاتی معمولی ممکن است شامل درک خواص شیمیایی مولکول‌های کوچک یا بیوتراپی‌های بالقوه باشد، از ارزیابی آبگریزی یک مولکول خاص تا ساختارهای قند روی یک آنتی‌بادی مونوکلونال که بر پاسخ ایمنی تأثیر می‌گذارد.

یکی از موارد استفاده خاص، اطمینان از قوام مواد فعال دارویی (API) است. HPLC می تواند تجزیه و تحلیل کمی مولکول های انتخاب شده را ارائه دهد، بنابراین می توانید دوز صحیح مواد فعال را تأیید کنید. برد می‌گوید: «برای آزمایش QA/QC، HPLC می‌تواند در حصول اطمینان از ویژگی‌های کیفی حیاتی مانند قدرت/غلظت، یکنواختی محتوا، تشخیص و تعیین کمیت ناخالصی‌ها، و کیفیت و هویت مواد خام مفید باشد».

ناخالصی ها می توانند خطر ایمنی جدی برای بیماران داشته باشند و تشخیص و شناسایی آنها اغلب با استفاده از HPLC تسهیل می شود. تکنیک‌های استاندارد HPLC ممکن است با روش‌های تشخیص بسیار کارآمد (مانند تشخیص UV) ترکیب شوند تا مشخصات ناخالصی کامل و دقیقی ارائه کنند.

در روشی مشابه، HPLC می تواند در ارزیابی پایداری محصولات دارویی حیاتی باشد. ترکیبات فرمولاسیون می تواند در طول زمان به دلیل عوامل محیطی مختلف مانند قرار گرفتن در معرض رطوبت، اکسیژن، گرما و نور تغییر کند. HPLC می تواند در شناسایی محصولات تخریب و همچنین تعیین میزان تغییر در طول زمان کمک کند.

در واقع، برد خاطرنشان می کند که HPLC همچنین می تواند در تعیین عمر مفید مفید باشد. به عنوان مثال، برخی از بیوتراپی ها در طول زمان به تجمع حساس هستند یا اگر به درستی ذخیره نشده باشند، می توان از HPLC برای نظارت بر این تجمع استفاده کرد.

عواملی که هنگام استفاده از HPLC باید در نظر گرفته شود

اگرچه HPLC بسیار مفید است، اما روش ها و تجهیزات مناسب باید برای هر کاربرد خاص انتخاب شود. چندین عامل اصلی وجود دارد که در اینجا باید در نظر گرفته شود. به ویژه در داروسازی، الزامات نظارتی، روش‌ها، تجهیزات و مشخصات مناسب را تعیین می‌کند. به عنوان مثال، سازمان غذا و دارو (FDA) سند راهنمایی با عنوان Validation of Chromatographic Methods که انواع مختلفی از روش های HPLC را پوشش می دهد ارائه می دهد. سایر نهادهای نظارتی که ممکن است نحوه آزمایش محصولات را در مناطق مربوطه خود اعمال کنند عبارتند از Health Canada و آژانس نظارتی داروها و محصولات بهداشتی بریتانیا.

برد توضیح می‌دهد که «عوامل زیادی بر کیفیت جداسازی تأثیر می‌گذارند (طراحی ابزار، شیمی فاز ستون و متحرک، پارامترهای تزریق، و دمای ستون)» و این متغیرها باید به خوبی درک شوند.

HPLC دو رویکرد رایج فاز عادی و فاز معکوس هستند. در هر دو، جداسازی بر اساس قطبیت است. در HPLC فاز معمولی، ماده جاذب قطبی و حلال غیرقطبی (معمولاً یک مایع آلی) است که در نتیجه اجزای قطبی کمتری از نمونه ابتدا شسته می‌شوند. فاز معکوس دقیقا مخالف فاز قبلی است، بنابراین اجزای قطبی بیشتر سریعتر از ستون خارج می شوند.

انواع دیگر HPLC شامل تبادل یونی (بر اساس بارهای یونی) و کایرال (برای جداسازی انانتیومرها) است. در حالت دوم، ماده فاز ساکن دارای منافذی است که مولکول های کوچکتر را کند می کند. همچنین کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا (UHPLC) وجود دارد که از ستون کوچکتر و ذرات کوچکتر نسبت به HPLC استفاده می کند و در نهایت منجر به فرآیند کارآمدتر می شود.

دستگاه UPLC یک دستگاه همه کاره است، به ویژه هنگامی که با آشکارسازهای مختلف، مانند طیف سنجی UV-Visible (UV-Vis)، طیف سنجی جرمی (MS)، و فلورسانس ترکیب شود. به عنوان مثال، UV-Vis می تواند به تعیین غلظت مولکول ها پس از شستشو از ستون کمک کند. یک روش تشخیص بسیار خاص MS است که می تواند به اندازه گیری نسبت جرم به بار یک مولکول و در نتیجه وزن مولکولی آن کمک کند. فلورسانس می تواند به ویژه برای انواع مناسب آنالیت ها با محدودیت های تشخیص قسمت در میلیارد (ppb) حساس باشد.

شکی نیست که HPLC نقش مهمی در تجزیه و تحلیل دارویی دارد. دقت و تطبیق پذیری آن، آن را به ابزاری مناسب برای بسیاری از مراحل توسعه و تولید بیوتراپی تبدیل کرده است. در حالی که تعدادی فاکتور وجود دارد که باید هنگام طراحی آنالیز HPLC در نظر گرفت، انعطاف پذیری ذاتی این تکنیک، از جمله سازگاری آن با چندین فناوری پیشرفته، آن را به انتخابی عالی برای طیف وسیعی از کاربردها تبدیل می کند.

تماس با ما:

جهت دریافت کاتالوگ محصولات و قیمت روز با بخش فروش شرکت ویتا طب تماس حاصل فرمایید

• تماس: 02122277131-02122919474-02166714383

  همراه:09199060602

  فکس: 02122919474

  ایمیل:sales1.vtk@gmail.com

یک آزمایشگاه غذا HPLC را برای آنالیز آفت کش ها و سایر مواد شیمیایی نیاز دارد. به طور کلی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به عنوان یک روش کروماتوگرافی که برای جداسازی مخلوطی از ترکیبات در زمینه‌های شیمی تجزیه، بیوشیمی و صنعت استفاده می‌شود، توصیف می‌شود. هدف اصلی استفاده از HPLC شناسایی، تعیین کمیت و خالص سازی اجزای جداگانه مخلوط است. اجزای اولیه در یک سیستم HPLC شامل مخزن حلال یا مخازن متعدد، پمپ فشار بالا، ستون، سیستم انژکتور و آشکارساز است.

از آنجا که مقاله به صنایع غذایی مربوط می شود، ابزار دقیق HPLC برای تشخیص ترکیبات شیمیایی که اغلب در کشاورزی دخیل هستند استفاده می شود. آفت‌کش‌هایی که از محصولات در برابر علف‌های هرز و آفات محافظت می‌کنند، حاوی آنالیت‌های هدف برای آزمایشگاه HPLC برای شناسایی و تعیین کمیت هستند. سایر مواد شیمیایی که در تولید مواد غذایی مورد استفاده قرار می گیرند رنگ ها، نگهدارنده ها، آنتی اکسیدان ها، طعم دهنده ها و شیرین کننده های مصنوعی و غیره هستند.

در حالی که استفاده از مواد شیمیایی در کشاورزی مدرن و تولید مواد غذایی مزایای خاصی دارد، برخی از این مواد شیمیایی ممکن است برای انسان خطرآفرین باشد. باقی مانده های شیمیایی را می توان در غذاهای با منشاء حیوانی مانند شیر، تخم مرغ و گوشت یافت. به دلیل سمی بودن آنها، سازمان های دولتی سطوح مجاز را برای ماهیت و غلظت مواد شیمیایی و باقی مانده های دارو در محصولات غذایی تعیین کرده اند. نظارت اجباری بر این باقیمانده ها به منظور اطمینان از اینکه آنها از سطوح تجویز شده تجاوز نمی کنند مورد نیاز است.

در نتیجه، روش های خاص HPLC به منظور محافظت از مصرف کنندگان توسعه یافته است. تشخیص و/یا تعیین کمیت اکثریت قریب به اتفاق آنالیت های غذایی بر اساس فراریت و قطبیت نسبی آنها عواملی هستند که باید هنگام انتخاب یک روش تحلیلی مناسب برای تعیین آنها در نظر گرفته شوند. آنالیز آزمایشگاهی HPLC ثابت کرده است که یک فناوری بهینه برای بسیاری از این کاربردها است. روش‌های کروماتوگرافی HPLC برای جداسازی مخلوط‌های پیچیده به ترکیبات جداگانه مورد استفاده قرار می‌گیرند، که سپس توسط آشکارسازهای مناسب و سیستم‌های مدیریت داده شناسایی و تعیین می‌شوند.

آزمایشگاه های آنالیز غذا و دارو  از کروماتوگرافی مایع و گاز برای سنجش طیف وسیعی از آزمایش‌ها مانند مایکوتوکسین‌ها، ویتامین‌ها، پروفایل‌های قند، کلسترول و پروفایل‌های اسیدهای چرب بر روی انواع مختلف نمونه استفاده می‌کند.

برخی از آزمایشات متداول انجام شده توسط آزمایشگاه های غذا و دارو  با دستگاه HPLC  عبارتند از:

تشخیص و تعیین کمیت مایکوتوکسین ها

• آفلاتوکسین توتال

• آفلاتوکسین G1

• آفلاتوکسین B1

• آفلاتوکسین G2

• آفلاتوکسین B2

• استفراغ

• زرالنون

• اکراتوکسین A

کمی سازی نرم کننده های خمیر و مواد سفید کننده آرد

• آزودی کربنامید
• بنزوئیل پراکسید.

آنالیز ویتامین ها:

• ویتامین A (رتینول یا رتینیل پالمیتات)

• ویتامین B1 (تیامین)

• ویتامین B2 (ریبوفلاوین)

• ویتامین B3 (نیاسین)

• ویتامین C (اسید اسکوربیک)

• ویتامین D (کوله کلسیفرول و ارگوکلسیفرول)

• اسید فولیک

تجزیه و تحلیل  قند برای NLEA توسط HPLC انجام می شود

• فروکتوز
• گلوکز
• ساکارز
• مالتوز
• لاکتوز
• سوکرالوز

تماس با ما:

جهت دریافت کاتالوگ محصولات و قیمت روز با بخش فروش شرکت ویتا طب تماس حاصل فرمایید

• تماس: 02122277131-02122919474-02166714383

  همراه:09199060602

  فکس: 02122919474

  ایمیل:sales1.vtk@gmail.com